我蛋白桑：桑叶、蚕体中1-脱氧野尻霉素的含量测定与此分析

摘要 卜脱氧野尻霉素（ＤＮＪ）及其衍生物是一种高效的ａ．葡萄糖苷酶抑制剂，可用 于治疗糖尿病、肥胖症、病毒感染等疾病。已发现多种植物和微生物具有合成和 积累ＤＮＪ的特性，其中以桑叶中的含量最高。蚕一生食桑，其体内的ＤＮＪ含量远 高于桑叶。受测试方法的限制，目前对于桑叶和蚕体中ＤＮＪ含量的变化或富集规 律的系统研究并不多。本文建立了反相高效液相色谱一紫外检测法（ＲＰ—ＨＰＬＣ—ＵＶ） 测定ＤＮＪ的方法，利用该方法系统研究了桑叶中ＤＮＪ含量的变化规律，以及蚕体 对ＤＮＪ的富集作用。植物生物碱是植物在与昆虫协同进化过程中形成的一大类具 有防御功能的次生代谢物质，ＤＮＪ是桑叶中含量较高的一种生物碱，但ＤＮＪ的对家 蚕以外的昆虫的影响作用研究也较少。本论文在这些方面进行了一些研究，主要 结果如下： １．ＤＮＪ测定方法。以Ｏ．０５ ｍｏｌ几的ＨＣｌ为溶剂提取蚕粉和桑叶粉中ＤＮＪ，９一 芴甲基氯甲酸甲酯（ＦＭＯＣ—Ｃ１）为衍生化剂，０．４ｍｏｌ／Ｌ硼酸钾缓冲液ｐＨ＝８．５中 进行衍生化反应，生成具有紫外吸收的ＤＮＪ—ＦＭＯＣ络合物，反相高效液相色谱一紫 外检测法测定ＤＮＪ—ＦＭＯＣ。结果表明：衍生产物的色谱分离效果好，ＤＮＪ—ＦＭＯＣ峰面 积与ＤＮＪ浓度呈正相关，加样回收率为９４．９８％，精密度实验、重现性实验、稳定 性实验、回收率实验表明该方法可靠，可以作为家蚕、桑叶和相关药品保健品中 ＤＮＪ含量测定的有效方法。 ２．采用反相高效液相色谱（ＲＰ—ＨＰＬＣ—ＵＶ）法测定了野蚕、家蚕不同品系间、５ 龄幼虫不同组织器官以及家蚕幼虫５龄不同生长时期的卜脱氧野尻霉素（ＤＮＪ）含 量。结果表明：野蚕与家蚕、家蚕不同品系间ＤＮＪ含量存在极显著差异。在测试 的样本中，野蚕全蚕粉中ＤＮＪ含量最高，为０．４２７８％，油蚕次之，黄血蚕最低，为 ０．２２０５％；家蚕不同组织中ＤＮＪ含量存在明显差异，蚕血粉含量最高，其次是中肠、 体壁和脂肪体。丝腺几乎检测不出ＤＮＪ；蚕体内ＤＮＪ含量随蚕的发育呈明显变化， 从利川降血糖成分ＤＮＪ的角度 看，以油蚕制作全蚕粉，５龄３天一４灭的幼虫是比较好的。 ３．测定栽培桑鲁桑、白桑、山桑、３大类９个品种，野牛桑蒙桑、鬼桑、华桑、 长果桑４大类６个品种的ＤＮＪ含量，结果显示：ＤＮＪ含量蒙桑＞鬼桑＞长果桑＞鲁桑＞ 山桑＞白桑＞华桑，蒙桑含量最高，华桑最低；蒙桑、鬼桑、长果桑３种野生桑中 ＤＮＪ含量极显著高于其他种；栽培种中自桑和Ｆ日白桑ＤＮＪ含量最高为０．１１％，垂枝 桑含量最低，为０．０２１％；鲁桑三个品种的含量在栽培种中均较高，为０．０７５—０．１０５％； 不同地方栽培品种ＤＮＪ含量差异大。桑叶浆液汁中的ＤＮＪ含量极其显著高于桑叶 全叶、叶片、叶脉，ＤＮＪ主要存在于桑叶浆液汁中。研究显示，野生桑是很好的利 用活性物质的材料来源。 ４．采用盐酸酸抽提，阳离子交换提纯法从全蚕粉和桑叶粉中获得分别获得ＤＮＪ 产品的得率为１．４７８９％和０．４８９９％，纯度为６２．９２６９％和８５．７８７７％。结果表明，盐 酸抽提，阳离子交换提纯法提取桑、蚕中ＤＮＪ是一个比较可行的方法。产品的ＤＮＪ 纯度都高于６０％，是目前比较理想的方法。 ５．以来自烟草夜蛾卵巢的培养细胞ｓｆ９、ｓｆ２１和家蚕卵巢培养细胞ＢＩｆｌＮ为实验 对象，分别以不同浓度ＤＮＪ对三种培养昆虫细胞添加处理，培养一定时间后，ＭＴＴ 法测定细胞增殖抑制率。处理３６小时时对三种细胞增殖仅表现为轻微抑制或促进作用，但没有呈现一定规律，表明此时ＤＮＪ没有对细胞增殖形成明显影响。处理 ７２小时，ＤＮＪ对家蚕ＢＩＩｌＮ细胞表现为促进作用，有剂量效应，低浓度时高促进增 殖，高浓度促进作用降低；对ｓＦ２１增殖表现为抑制作用，抑制率呈现剂量效应， 高浓度抑制率高，低浓度抑制率低，表现出ＤＮＪ对ｓｆ２１的毒性作用；ＤＮＪ对Ｓｆ９ 细胞增殖有促进作用，不同浓度均有较高的增殖促进作用，但没有规律性。

神经细胞的损伤和破坏，同时提高体内超氧化物歧化酶 的活性，阻止超氧化物的形成，从而对神经系统机能的衰老起延缓作用。朱祥瑞 等瓣研究发现桑叶可提赢清除自由基酶的活性，降低组织中的脂褐素，具有清除自 由基、延缓衰老的作用。太川幸予１４２】研究发现桑叶具有抑癌作用，可能是维生素、 ＳＯＤ和黄酮类化合物的综合作用结果。此外，桑叶还具有抗炎、抗动脉嫒化和抗 丝虫等功效。综上所述，桑叶对生物体具有多种药理作用，可以维持和增进生物 体的健康。所以桑叶被开发成多种保健品上市，受人亲睐，如桑叶茶、桑叶汁饮 料，功能保健性食髭、超细粉未的食晶添加荆、桑时保健酒及桑叶酸奶等。 １．２家蚕幼虫的化学成分及药理作用的研究进展 家蚕幼虫是以桑时为主要天然饲料，它们从桑叶中摄取维持身体机能和成长所 必需的各种营养物质，主要包括蛋白质、糖类、脂质、维生素、无机盐和水分等。 蚕体干物主要是糨蛋自。吃较蚕体和桑叶的主要成分，发现蚕体中粗蛋盘、粗脂 肪、灰分、Ｚｎ明显高于桑叶，而拳Ｒ纤维、纤维素、半纤维素、术质素、中性洗涤 纤维（ＮＤＦ）、酸性洗涤纤维（ＡＤＦ）等明显低于桑叶。糖类在桑叶中的主要存 在形式是果糖和纤维素，其含量约占桑叶干物质的３５％．４０％，褥在家蚕体中雯主 要以海藻糖的形式存在，其含量约占皿糖总量的９０％以上。蚕粉中含有１９种游离 氨基酸（约占２ｌ。５％），生物活性多肽含量丰富（＞６毽眈），还含有Ｓ∞、凝集素、 保幼激素多种维生素和海藻糖等，这些成分是机体构成和维持币常生理功能所必 需的。生物活性多肽是与生长、发育、免疫、造血等重要生命活动都密切相关的 重要物质，海藻糖具有保护生物细胞和生物活性物质在脱水、高温、冷冻、高渗 透压及有毒物质等不良环境条件下活性免遭破坏的功能。凝集素具有抗病毒作用， ＳＯＤ其有抗衰老作用。另外，蚕粉中还含有特殊功能的活性物溪生物碱．１一脱氧野 尻霉素（ＤＮＪ），占干品的Ｏ．４％。家蚕幼虫体的药用价值很早就被人们所认识。在 《齐民要术》、《天工开物》、《神农本革》、《本草纲目》等古代医书中都有家蚕幼 虫体入药的记载。其功效势主治小夕毛疳热、消瘦、消漏（郄糖尿病）等疾病。现 代医药学进一步证明了家蚕幼虫体的药用价值，并在其药理学基础方面进行了深 入研究。研究发现家蚕幼虫体在调节入体新陈代谢、降低血脂、护肝等方面均有 显著的作用。在循环系统方面，自１９９２年起，韩国蚕丝昆虫研究所，对蚕的生理 功能及实用效果进行了深入研究，证明了５龄第３天家蚕幼虫经冷冻干燥制成的 全蚕粉末舆有治疗糖尿病的功效。因为蚕粉对于人体内的葡萄糖营酶的活性作用 具有较强的抑制作用，有效阻碍二糖水解为人体易于吸收的单糖，从而降低血糖 值，适合糖尿病患者长期服朋此外，蚕粉还能降低血脂与胆固醇，对心斑管疾病 具有一定的治疗作用。 家蚕幼虫体具有良好降衄糖作用的药理学基础是寓含多种降血糖的活性物 质，已查明主要还有黄酮类纯合物、蛋自质多肽ＰＴ豫、甾族激素姗。蚕粉－ｆ，含订高比例的小饱和脂肪酸，其中包括人体必需脂肪酸：（１一业麻酸、 亚油酸，还含有较高的维乍豢Ａ。哑麻酸具有明显的降血压、降血脂、降Ｈ｝ｌｌ＾ｌ醇 的作用，同时也具仃较；〔Ｊ，的抗炎作用ｌｌ引。而家蚕幼虫体内富含的高比例不饱和脂 肪酸是其调：爷血脂的｝要活性物质之一。在抗癌、抑制肿瘤和提高免疫力方而， 蚕粉中主要含蛋Ｆ１质、多种氨基酸、脂肪酸和多糖，还有少量抗菌肽、干扰素和 微量元素硒等，其中氨基酸、多糖、抗菌肽和硒等经证实具有抗癌作用。蚕粉中 含的干扰素是已知的‘种具抗痛作用的化学物质，因此具备较强的抑制肿瘤作用， 尤其是对肺癌效果明显。蚕宝素是在家蚕中提取得到的一种可透析物，其中主要 含蛋白质、１8种氨基酸和ｌｏ余种微量元素。进行的抗肿瘤实验，证明 其对肿瘤抑制率很高。而如此丰富的营养组成，同样适用于蛋白代谢障碍、白蛋白低下的患者，在提高机体免疫力、强身健体等方面有其独特的优势，同时间接 地起到护肝作用。方予龙等报道，蚕粉还有抗疲劳的功效。 １．３利用蚕桑产品产物治疗糖尿病 利用桑、蚕及其相关产物治疗消渴病，在传统中医著作和国内外民间验方、秘 方中早有记载。《本草纲目》中记载，桑叶“汁煎代茗，能止渴消渴”，“灸熟煎饮， 代茶止渴”。桑叶水提物、蚕沙、蚕茧汤等都是常用的治疗糖尿病的蚕桑产品。１９６３ 年Ｓｈａｎ等最早报道了桑叶水提取液具有降血糖作用。１９７６年Ｙｏｓｈｉａｋｉ等首次 从桑树中分离到１一脱氧野尻霉素（１．ｄｅｏｘｙｎｏｊｉｒｉｍｙｃｉｎ，ＤＮＪ）。２０世纪９０年代， Ａｓａｎｏ等从桑叶中分离出６种生物碱，Ｋａｔｏ确定了其结构。础ｍｕｒａ等研究了以 上６种化合物的降血糖效果，确认ＧＡＬ．ＤＮＪ和ｆａｇｏｍｉｎｅ降血糖作用最强。已有 的研究表明，桑叶的水提取物、醇提取物降血糖和治疗糖尿病的有效成分包括 ＤＮＪ、桑叶多糖、黄酮类物质等【圯Ｊ。 桑白皮又名桑根皮、桑皮。性寒味甘，归肺经。《别录》载：“去肺中水气， 唾血，热渴，水肿，腹满肿胀，利水道，可以缝金疮”。２０世纪７０年代从桑白皮 中分离出ｍｏｒａｌｌｏｌｉｎｅ并证实它有降血糖的作用。蚕沙是一种临床常用的中药材， 中医认为具有祛风出湿、活血定痛的作用。蚕茧或缫丝汤具有滋阴润燥、生精止 渴作用，主治多饮、不生肌肉、肾消白浊和上中二消等疾病。应用家蚕全蚕粉治 疗糖尿病，最早始于韩国学者的研究，自１９９２年，就蚕粉对人 体的生理效应进行了系统研究，发现５龄第３天冻干蚕粉的降糖活性最高，蚕品种、饲养季节和饲料等能影响降血糖活性。利用全蚕粉制作的降血糖制剂已在韩 国、泰国等国家上市，获得了良好的评价，目前韩国饲养的蚕８０％以上用于生产 治疗糖尿病的药物。国内学者也研究确认了蚕粉或蚕蛹粉的降血糖效果，同时 具有降血脂、抗疲劳等作用。崔为正等以全蚕粉为主要成分研制的复合药物，其 降血糖效果明显优于单纯全蚕粉。已有的研究成果表明，全蚕粉的主要作用是通 过其有效成分ＤＮＪ抑制小肠中二糖的分解从而抑制了小肠对二糖的吸收，降低餐 后的血糖值，从而起到降糖效果。